COME ESEGUIRE UN CORRETTO PRELIEVO, CONSERVAZIONE ED ANALISI
ARS-CoV-2 (COVID-19) è un nuovo ceppo di coronavirus che non era stato precedentemente identificato nell’uomo. E’ un virus ad RNA a singolo filamento il cui genoma ha dimensioni di ~ 30 kb. La trasmissione tra gli esseri umani si verifica attraverso uno stretto contatto con un individuo infetto che produce goccioline respiratorie (droplets). Il tempo medio di incubazione è di 4 giorni con un intervallo interquartile di 2-7 giorni, a significare che il 50% dei casi è disperso in questo periodo.
La diagnosi clinica di COVID-19 si basa sulla presenza di segni e sintomi, insieme alle indagini di laboratorio e imaging e soprattutto sulla ricerca di SARS-CoV-2 RNA nei tamponi rinofaringei o orofaringei. Infatti i Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ne raccomandano l’esecuzione per effettuare la diagnosi iniziale di infezione e per confermare l’avvenuta guarigione.
MODALITA’ ESECUZIONE DI UN TAMPONE ORO E NASOFARINGEO PER LA DIAGNOSI DI COVID-19
Il tampone viene materialmente eseguito in meno di un minuto. E’ minimamente invasivo e deve essere eseguito da personale adeguatamente formato. La necessità di una accuratezza di esecuzione è fondamentale perché il tampone rileva direttamente la presenza del virus nell’ospite, rispetto ai test sierologici che mettono in evidenza la risposta del sistema immunitario all’infezione.
La corretta esecuzione è quindi fondamentale perché, in caso contrario, si potrebbe generare un esito errato come un falso negativo che non rileva la presenza dell’infezione, successivamente individuata da ulteriori controlli. La sensibilità dei tamponi oro e nasofaringei è abbastanza alta e quindi il test è molto sensibile in quanto ha un numero ridotto di falsi negativi.
E’ interessante riportare le conclusioni di due recenti lavori1-2 per cui l’esame della saliva rappresenta un tool promettente per la diagnosi di Covid-19 con rilievi di sensibilità anche maggiori rispetto ad un tampone rinofaringeo. Nel rapporto dell’Istituto Superiore della Sanità su Covid-193 vengono riportate le raccomandazioni per il corretto prelievo, conservazione e analisi sul tampone oro/rinofaringeo per la diagnosi di COVID-19.
E’ molto vero che la «esecuzione materiale» sia particolarmente rilevante, ma è egualmente importante rispettare tutti i seguenti punti:
- per la esecuzione, il personale accuratamente addestrato, dovrà togliere i monili o altro oggetto personale;
- effettuare l’igiene delle mani con acqua e sapone o in alternativa con soluzione alcolica;
- indossare il primo paio di guanti e quindi il camice a manica lunga e la cuffia;
- mettere la mascherina FFP2/FFP3 e quindi gli occhiali o, in alternativa, lo schermo facciale;
- indossare il secondo paio di guanti.
Dopo la esecuzione del test, si provvederà alla svestizione, egualmente importante e ricordando, in particolare, di rimuovere la mascherina e gli occhiali/schermo protettivo facendo attenzione a non toccarli nella parte anteriore. Detergere le mani con acqua e sapone o in alternativa con soluzione alcolica e assicurarsi che il materiale utilizzato venga smaltito come rifiuto infetto e gettato nell’apposito contenitore.
Cosa si intende per tampone orofaringeo?
L’orofaringe fa parte della faringe ed è la continuazione della cavità orale; comunica superiormente con il rinofaringe e inferiormente con l’ipofaringe e la laringe. Il punto di passaggio fra la cavità orale e l’oro-faringe è dato da un piano verticale che passa per le papille linguali circonvallate, i pilastri tonsillari anteriori e il palato molle; l’orofaringe giunge posteriormente fino alla parete posteriore della faringe.
Per la esecuzione del tampone è necessario essere certi di raggiungere la parete faringea posteriore e le logge tonsillari dove il tampone dovrà essere strofinato per circa 10 secondi, evitando il contatto con la lingua, i denti e le gengive5.
Cosa si intende per tampone nasofaringeo?
Il rinofaringe fa parte della faringe di cui è la porzione più superiore. Anteriormente è in continuità con le fosse nasali; inferiormente è delimitato dal palato molle e quindi dall’orofaringe; superiormente dal basicranio; lateralmente si apre nella tuba uditiva che lo mette in connessione con l’orecchio; posteriormente corrisponde alle due vertebre C1 e C26-7.
Per la esecuzione si inserirà il tampone attraverso la narice, scivolando parallelamente al pavimento delle fosse nasali e quindi non con direzione verso l’alto; si procederà gradualmente per circa 6-8 cm, fino a quando non si giungerà in contatto con la parete posteriore del rinofaringe. Si lascerà il tampone in posizione per alcuni secondi per far assorbire le secrezioni, quindi rimuoverlo lentamente ruotandolo.
Se è presente una deviazione del setto nasale o altro ostacolo utilizzare lo stesso tampone per ottenere il campione dall’altra narice. Una volta terminato, il tampone va inserito nella provetta contenente il terreno di trasporto e spezzato.
COME VIENE EFFETTUATA IN LABORATORIO LA RICERVA DEL VIRUS NEL TAMPONE ORO/RINO-FARINGEO?
La diagnosi di laboratorio di infezione da SARS-CoV-2 si basa sul rilevamento dell’acido nucleico virale nelle secrezioni respiratorie mediante procedure raccomandate dalla Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS)8 e dal Centro per il Controllo delle Malattie (CDC) americano. Tale «test molecolare» viene eseguito in specifici Laboratori, individuati dalle Regioni in accordo con l’Istituto Superiore di Sanità (ISS), che dispongono di strumentazione validata, personale qualificato ed opportunamente formato in grado di assicurare i livelli di bio-contenimento indicati dall’OMS.
Il test molecolare RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE POLYMERASE CHAIN REACTION) consiste nella estrazione degli acidi nucleici dalle matrici biologiche con silice o biglie magnetiche, seguita dalla retrotrascrizione dell’RNA del virus in DNA complementare, dall’amplificazione simultanea o sequenziale e rilevazione di uno o più geni virali (E, S, N, RdRp, ORF1) mediante sonde fluorescenti [Figura 3].
I test di Real Time-PCR consentono di monitorare l’andamento della reazione durante i cicli di amplificazione: nella fase esponenziale di amplificazione esiste una proporzionalità diretta tra carica virale e numero di cicli necessari per produrre un risultato positivo; pertanto, una carica virale più elevata verrà rilevata con un minor numero di cicli di amplificazione (Ct, cycle threshold, più basso).
La positività del test varia in relazione alla fase dell’infezione, (come indicato in figura 5, in molti soggetti l’RNA virale può essere rilevato dal primo giorno dopo l’insorgenza dei sintomi; la carica virale raggiunge il picco mediamente dopo 5-6 giorni e comincia a declinare nella terza settimana per poi diventare non rilevabile) 9, al materiale biologico indagato (il liquido di lavaggio bronco-alveolare è positivo nel 93% dei casi, il tampone nasale nel 63% e quello faringeo nel 32%)10, ai criteri di positività adottati (numero di geni amplificati e ciclo soglia di amplificazione) ed all’accuratezza analitica del test molecolare utilizzato.
La positività del test RT-PCR dopo la terza settimana riflette soltanto la presenza di RNA virale nella matrice biologica e non necessariamente indica la presenza del virus vitale, come dimostrato dalla perdita della capacità infettante in specifiche linee di colture cellulare permissive dopo l’ottavo giorno di insorgenza dei sintomi della malattia10.
Nei pazienti che presentano un quadro sintomatologico e di imaging suggestivo di infezione di SARS-CoV-2 ma tamponi oro/rino-faringei negativi e in quelli asintomatici o paucisintomatici che vengono osservati tardivamente, potrebbe essere utile per confermare la diagnosi effettuare la ricerca degli anticorpi nel siero con metodi immunometrici quantitativi validati da studi indipendenti. Numerose evidenze scientifiche hanno dimostrato che dopo circa 3 settimane dall’inizio dei sintomi i differenti isotipi anticorpali sono presenti nella quasi totalità dei soggetti 11.
Infine occorre ricordare che, come per altri esami di laboratorio, numerose problematiche pre-analitiche (erronea identificazione del paziente, incorrette procedure di prelievo del campione e di conservazione e trasporto al laboratorio, prelievo eseguito al di fuori della finestra diagnostica, presenza di sostanze interferenti o somministrazione di trattamenti antivirali, ricombinazione del virus) o errori nella fase analitica (contaminazione del campione, utilizzo di procedure non adeguatamente validate, materiale inadeguato o insufficiente, malfunzionamento dello strumento, reagenti non conservati a temperatura controllata, ecc.) possono determinare un aumento rilevante del rischio di errori nella ricerca di SARS-CoV-2 RNA nei tamponi. Ogni risultato di laboratorio, pertanto, va valutato congiuntamente alle evidenze cliniche ed epidemiologiche e ai risultati di altri parametri biochimici o di indagini di imaging.
Direttore U.O.C. Patologia Clinica e Microbiologia. P.O. V. Fazzi – ASL LE
Dirigente medico U.O.C. Otorinolaringoiatria. P.O. V. Fazzi – ASL LE
Bibliografia
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- Saliva is more sensitive for SARS-CoV-2 detection in COVID-19 patients than nasopharyngeal swabs. Anne L. Wyllie et al.
- https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.16.20067835v1
- Raccomandazioni per raccolta, trasporto e conservazione di campioni biologici COVID-19 Gruppo di lavoro ISS Ricerca traslazionale COVID-19. Rapporto ISS COVID-19 •n. 11-13/2020 Gruppo di lavoro ISS Ricerca traslazionale COVID-19. Versione del 14 e 17 aprile2020
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- Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from Persons for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). Updated May 5, 2020. Centers for Disease Control and Prevention. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/guidelines-clinical-specimens.html
- Gray’s Anatomy: The Anatomical Basis of Clinical Practice, Expert Consult – Online and Print, 40e. Churchill Livingstone. ISBN: 9780443066849
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- Sethuraman et al. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA. Published on line May 6, 2020
- Long et al. Antibodies responses to SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. Nature Medicine. Published on line, April 29, 2020