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malattie auto immuni

LE PIU’ RECENTI RACCOMANDAZIONI BASATE SU EVIDENZE DI ELEVATA QUALITA’

 

A partire dalla prima descrizione effettuata nel 1958, la ricerca degli autoanticorpi antinucleo (ANA) ha svolto un ruolo strategico nel work-up diagnostico di un ampio spettro di patologie autoimmuni: lupus eritematoso sistemico (LES), malattia mista del tessuto connettivo (MCTD), sindrome di Sjogren, dermatopolimiosite, sclerodermia, artrite idiopatica giovanile, epatiti autoimmuni, colangite primaria biliare, ecc. Tradizionalmente gli ANA sono stati ricercati su tessuti di ratto (fegato, rene, stomaco) o su cellule Hep-2  mediante immunofluorescenza indiretta, una tecnica difficile da armonizzare a causa della soggettività e della variabilità tra operatori nella lettura dei preparati al microscopio a fluorescenza e nella ricognizione dei pattern di fluorescenza, nonché  dell’ampio numero di variabili che possono condizionare i risultati (diluizione del siero per lo screening, caratteristiche del substrato, anticorpi secondari, forza ionica dei tamponi, ecc.); ulteriore variabilità è attualmente aggiunta dal crescente utilizzo di sistemi automatici per il processamento dei vetrini con i vari substrati, dalla lettura ed interpretazione dei principali pattern di fluorescenza da sistemi esperti computerizzati e dall’uso di tecniche analitiche alternative (immunoenzimatica, chemiluminescenza, immunoblotting microarray planari e non planari).

Nonostante le numerose linee guida ed una vasta bibliografia sull’ impiego dei test per autoanticorpi nucleo-citoplasmatici nella diagnosi e nel monitoraggio delle malattie autoimmuni sistemiche, persistono ancora elevati rischi di inappropriatezza nella richiesta di questi test ed una significativa variabilità di comportamenti dei prescrittori nell’ambito delle strutture sanitarie nonché nella terminologia e nelle metodiche analitiche utilizzate dai laboratori di patologia clinica. Con l’obiettivo di uniformare la terminologia utilizzata per definire gli ANA, migliorare l’appropriatezza prescrittiva e ridurre il ricorso improprio alla richiesta di autoanticorpi per le variegate strategie diagnostico-assistenziali nelle malattie reumatiche autoimmuni, si fornisce una sintesi delle più recenti raccomandazioni basate su evidenze di elevata qualità per outcome critici ed essenziali e per la applicabilità/rilevanza dei risultati per i pazienti.

  • Il termine autoanticorpi antinucleo e l’acronimo ANA, riferendosi ad un vasto spettro di autoanticorpi diretti verso antigeni situati in differenti strutture cellulari che comprendono costituenti nucleari, componenti della membrana nucleare e cellulare, dell’apparato mitotico, del citosol e di vari organelli citoplasmatici, deve essere sostituito con il termine “ANA-anticorpi anti-antigeni cellulari”, al fine di esplicitare che la ricerca comprende gli autoanticorpi diretti verso tutti i costituenti cellulari rilevabili con le attuali procedure analitiche utilizzate;
  • Allo stesso modo l’acronimo ENA (Extractable Nuclear Antigens) risulta inadeguato ad indicare tutte le specificità anticorpali verso gli antigeni nucleo-citoplasmatici attualmente rilevabili e sarà sostituito dal termine “Autoanticorpi anti antigeni intracellulari specifici”;
  • Poiché il test “ANA-anticorpi anti-antigeni cellulari” non è specifico di malattie reumatiche autoimmuni in quanto autoanticorpi diretti contro vari antigeni cellulari sono presenti in corso di malattie infettive, neoplasie, trattamento con farmaci, soggetti sani ed individui anziani, si raccomanda di richiedere l’esame come supporto alla diagnosi o classificazione di malattia solo in pazienti con caratteristiche cliniche suggestive di patologia reumatica autoimmune: lupus eritematoso sistemico (LES), malattia mista del tessuto connettivo (MCTD), sindrome di Sjogren, dermatopolimiosite e sclerodermia;
  • Il test “ANA-anticorpi anti-antigeni cellulari” ha un elevato potere predittivo negativo solo per LES e MCTD; si raccomanda, pertanto, di non richiedere il test per escludere altre malattie reumatiche autoimmuni;
  • La ripetizione del test “ANA-anticorpi anti-antigeni cellulari” risultato negativo o positivo a basso titolo (1:80) è consigliabile soltanto in caso di successiva comparsa di segni e sintomi clinici sospetti;
  • In relazione alla scarsa correlazione del titolo degli “ANA-anticorpi anti-antigeni cellulari” ottenuto mediante metodica di immunofluorescenza indiretta (IFI) su cellule Hep-2 con l’attività della malattia, nei pazienti con diagnosi consolidata di malattia reumatica autoimmune non è appropriata la ripetizione del test se non in presenza di mutamenti del quadro clinico tali da indicare variazione nella diagnosi e/o nell’approccio terapeutico;
  • Per la ricerca degli ANA-anticorpi anti-antigeni cellulari si raccomanda la metodica IFI utilizzando cellule Hep-2 come substrato, in quanto le procedure analitiche alternative non sono dotate di analoga sensibilità diagnostica; i laboratori che eventualmente utilizzano metodiche analitiche differenti devono specificare nel referto il metodo analitico utilizzato e le specificità antigeniche presenti nel sistema.
  • Al fine di una migliore discriminazione tra popolazione sana e ammalata, nella determinazione degli ANA-anticorpi anti-antigeni cellulari in IFI si raccomanda di utilizzare una diluizione iniziale del siero di 1:80, specificandola nel referto; il titolo di 1:80 deve essere considerato basso positivo; il titolo < 1:80 negativo, mentre il titolo ≥ 1:160 va considerato positivo;
  • Nella refertazione del test ANA-anticorpi anti-antigeni cellulari si raccomanda di riportare, oltre al titolo, anche il pattern fluoroscopico (Fig. I, II, III) con descrizione morfologica (omogeneo, speckled, nucleolare, ecc.) al fine di orientare nella scelta di eventuali ulteriori test di approfondimento e dei metodi da utilizzare  per la ricerca di autoanticorpi anti-antigeni cellulari specifici; sebbene esista una correlazione tra quadro fluoroscopico e specificità antigenica riconosciuta dagli autoanticorpi ed alcune malattie reumatiche, tale associazione non è assoluta e la specificità antigenica non può essere dedotta dal pattern di fluorescenza;
  • In presenza di un risultato del test ANA-anticorpi anti-antigeni cellulari positivo in IFI con titolo ≥ 1:160  è raccomandato effettuare la caratterizzazione delle specificità anticorpali dirette contro i diversi antigeni intracellulari (cosiddetti ENA, Fig. IV); la ricerca degli anticorpi anti-antigeni intracellulari specifici può essere eseguita anche per ANA assenti o positivi a basso titolo se il paziente presenta sintomi clinici o dati di laboratorio suggestivi di patologie autoimmuni, in particolare sindrome di Sjogren, lupus neonatale, lupus cutaneo subacuto o dermatopolimiosite;
  • Nell’ottica di un percorso diagnostico efficace e di contenimento dei costi nei pazienti con sospetta malattia reumatiche e/o ANA positivi si raccomanda di limitare la ricerca degli autoanticorpi anti-antigeni intracellulari a quelli compatibili con il quadro fluoroscopico e caratterizzati da importanza diagnostica definita o individuati come criteri di classificazione delle malattie reumatiche (anti-SSA/Ro60 e Ro52, anti-SSB/La, anti-Sm, anti U1RNP, anti-Scl70; anti-Jo1, anti-RNA polimerasi III); la ricerca delle specificità anticorpali dirette verso antigeni di riscontro meno frequente è raccomandata solo in presenza di ANA positivi con pattern nucleare tipico (anti-istoni, nucleosomi, PCNA, Ku, Sp100, CENP-A e fibrillarina) o in caso di positività citoplasmatica granulare/diffusa (AMA-M2 ed anti-proteina P ribosomale) o in caso di sospetta miopatia infiammatoria (Mi-2, Ku, anti-aminoacil-tRNA sintetasi, SRP, PM-Scl75/100) ;
  • Al fine di perseguire la massima appropriatezza in fase prescrittiva ed abbreviare i tempi di risposta, si raccomanda di utilizzare per i pazienti degenti nelle differenti U.O. per cui si sospetta una malattia reumatica autoimmune, la cosiddetta metodologia ANA-reflex, che consiste nella richiesta, corredata di sintomi e segni clinici, del solo test ANA; in caso di positività degli ANA con metodica IFI su substrato costituito da cellule Hep-2, gli operatori del laboratorio eseguiranno ulteriori esami di approfondimento mediante un algoritmo diagnostico ragionato basato su linee guida ed evidenze scientifiche ed in relazione al titolo anticorpale, al pattern di fluorescenza ed alle notizie cliniche fornite; mentre in caso di test ANA negativo o positivo a basso titolo non saranno eseguiti ulteriori accertamenti;
  • Poiché i metodi di laboratorio attualmente disponibili per la ricerca degli anticorpi anti-antigeni intracellulari specifici sono numerosi e con caratteristiche diagnostiche variabili, si raccomanda di riportare nel referto i metodi analitici utilizzati;
  • La determinazione quantitativa degli anticorpi anti-antigeni intracellulari specifici non è utile per la diagnosi, il monitoraggio e la prognosi della malattia, né per valutare l’efficacia della terapia, con l’unica eccezione della MCTD in cui la presenza di elevate concentrazioni di anti U1RNP rappresenta un criterio diagnostico; non è raccomandata la ripetizione del test in assenza di variazioni del quadro clinico;
  • La determinazione degli anticorpi anti ds-DNA (DNA nativo o a doppia elica) è raccomandata in caso di forte sospetto clinico di LES o di positività degli ANA ad un titolo ≥ 1:160 con un quadro di fluorescenza nucleare omogeneo;
  • Per la determinazione degli anticorpi anti ds-DNA si raccomanda di utilizzare un metodo immunometrico quantitativo e di riportare nel referto la concentrazione degli autoanticorpi e di indicare il metodo analitico utilizzato e di utilizzare come eventuale test di conferma il metodo IFI su substrato di Crithidia luciliae con una diluizione iniziale del siero di 1:10;
  • L’intervallo di tempo per la ripetizione della determinazione degli anticorpi anti-ds-DNA varia nelle diverse forme cliniche della malattia; la concentrazione degli anti-ds-DNA  e le sue variazioni correlano con l’evoluzione della nefropatia lupica.

Conclusioni

La ricerca degli autoanticorpi anti antigeni cellulari costituisce un elemento indispensabile per la diagnosi clinica, la stima della prognosi, la personalizzazione del trattamento e la pianificazione del follow-up di alcune malattie reumatiche sistemiche; al fine dell’ottimale utilizzo dei risultati prodotti dai laboratori è indispensabile la stretta collaborazione tra i patologi clinici ed i medici che assistono i pazienti per poter definire le specifiche di qualità analitica delle prestazioni diagnostiche, uniformare le procedure metodologiche ed utilizzare i test nelle condizioni per le quali esistono evidenze di elevata forza di efficienza economica e di efficacia clinica nel migliorare gli outcome per gli assistiti.

FIG. I. ANA ricercati con immunofluorescenza indiretta su cellule Hep-2: titolo 1:320; pattern mogeneo

fig-1

Fig. II.  ANA positivi con pattern centromerico

fig-2

Fig.III. ANA positivi: pattern nucleolare

fig.3

Fig. IV. Anticorpi diretti perso differenti antigeni intracellulari ricercati mediante immunoblot

fig-4

Fig. V. Autoanticorpi anti ds-DNA ricercati medianti IFI  su Crithidia luciliae

fig-5

 

 

Dr Giambattista Lobreglio

Dr Giambattista Lobreglio

Dr.sa Debora Lobreglio

Dr.Ssa Debora Lobreglio

 

 

 

Bibliografia

 

  • Guidelines for the laboratory use of autoantibody tests in the diagnosis and monitoring of autoimmune rheumatic diseases. Revision 2015. Riv Ital Med Lab DOI 10.1007/s13631-015-0099-X
  • Agmon-Levin et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis 2014;73:17:23
  • Von Muhlen et al. How to report he antinuclear antibodies (anti-cell antibodies) test on Hep-2 cells: guidelines from the ICAP initiative. Immunol Res 2021;69:594-608 
  • Bonroy et al. Detection of antinuclear antibodies: recommendations from EFLM, EASI and ICAP. Clin Chem Lab Med 2023;61:1167-1198
  • www.ANApatterns.org 

 

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